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医用真空冷冻干燥机：血小板冻干再水化的条件及其凝血功能变化

      血小板(plaet)是由骨髓巨核细胞产生并释放于血液循环中的zui小细胞,在止血和凝血过程中发挥着重要的作用。 由于血小板保质期较短，临床输注需求量大， 加之临床输注需求时间的不确定性， 造成了血小板过期浪费和临床供不应求的两难尴尬局面。 目前国内血小板主要保存方式是22℃振荡保存，有效期为 5d。 此外血小板还可深低温冰冻保存， 但这种方法的保存效果和临床疗效不确切。 冷冻干燥技术已广泛应用于各种生物材料的保存， 冻干制品具有常温下保存、 性能稳定、便于运输的特点。 本研究以过期血小板为原料，探索血小板冻干再水化的条件，检测其冻干再水化后凝血功能的变化， 为过期血小板再利用及新鲜血小板冰冻或低温保存研究提供了依据。

1、 材料与方法

1.1 实验材料

       1.1.1 血小板来源 实验组选择体检合格， 一周内未服用阿司匹林等抗血小板**的自愿献血者，用血细胞分离机单采富含血小板血浆，22℃振荡保存 5d 过期；对照组选择新鲜机采血小板。

       1.1.2 主要试剂和溶液 海藻糖 (CH22O11·2H2O，北京经科宏达生物技术有限公司)； 牛血清白蛋白(BSA，上海生工生物工程有限公司)；磷酸盐缓冲液(PBS)； 血小板聚集诱导剂二磷酸腺苷(ADP，Sigma公司)；凝血酶(Sigma 公司)；胶原(Sigma 公司)；瑞斯托霉素(Sigma 公司)；CD62P-PE(Bioscience 公司)；PAC-1-FITC(BDIS 公司 )； 海藻糖加载缓冲液 ( 含50mmol/L 海藻糖，100mmol/L NaCl，10mmol/L KCl，10mmol/L EGTA，pH 为 6.8)；冻干保护剂(含 20%海藻糖 ，1% 牛血清白蛋白 ，9.5mmol/L HEPES，142.5mmol/L NaCl，4.8mmol/L KCl，1mmol/L Mg-Cl2)；复水溶液为 PBS 缓冲液和蒸馏水以 3:1 比例混合制成。 以上试剂和溶液均在有效期内。

1.2 主要仪器 



医用真空冷冻干燥机、恒温振荡水浴、流式细胞仪、血球计数仪、血小板聚集仪

1.3 实验方法

        1.3.1 血小板的冻干保存 血小板浓缩液离心洗涤后重悬于海藻糖加载缓冲液中， 将上述悬浮液转移进入离心管中，并用聚四氟乙稀生料带密封，于37℃水浴中振荡孵化 4h。 将孵化后的血小板悬浮液 800g 离心 3min。 去除上层孵化液，得到沉淀的血小板块，加入冻干保护液打散重悬，使用血球计数仪进行计数， 调节血小板在冻干保护液中的浓度为 1×109个/ml。 将制备好的血小板冻干悬浮液装入特制冻干血盒中，密封充注口。 将血小板冻干悬液先以 20℃/min 的速率冻结至-40℃， 预冻 2h后，再以 1.5℃/min 对搁板升温至-30℃，退火 0.5h，然后进入一次干燥，-38℃维持一次干燥条件 20h，zui后以 0.2℃/min 的加热速率使隔板温度升高至20℃，维持二次干燥条件 10h 直至冻干结束。 冻干的血小板密封保存在室温。

1.3.2 冻干血小板的水化 将 PBS 缓冲液和蒸馏水以 3:1 的比例混合制成血小板冻干复水液，将1ml 复水液在室温下直接加入冻干样品瓶中，轻轻震荡直到样品完全溶解于复水溶液中。

1.3.3 检测血小板回收率 用血球计数仪分别对冻干前和冻干再水化后的血小板计数， 计算冻干再水化血小板回收率。冻干再水化血小板回收率(%)=冻干再水化后血小板计数/冻干前血小板计数×100%。

1.3.4 检测血小板稳定性 冻干再水化血小板分别在室温放置 0h、2h、4h、6h、8h 后，用血球计数仪测定血小板回收率。

1.3.5 血小板形态及超微结构观察 用扫描电镜观察血小板的形态；分别以戊二醛固定、脱水、环氧树脂包埋后制作超薄切片， 用透射电镜观察血小板超微结构变化。

1.3.6 血小板聚集反应检测 将冻干血小板复水后转入离心管中进行洗涤以去除细胞外保护剂，再用新鲜冰冻血浆重悬血小板， 调整血小板浓度为(0.2~0.3)×1012/L。 用 APACT-2 型血小板聚集仪检测冻干再水化后血小板对四种同浓度诱导剂—凝血酶、胶原、ADP 和瑞斯托霉素的聚集反应。

1.3.7 血小板表面糖蛋白检测 用三色流式细胞仪分别检测冻干再水化血小板表面激活指标 CD62p和 PAC-1 的表达，经凝血酶激活后测定 CD62p 和PAC-1 的再表达。 再表达率=凝血酶处理后表达率-血小板表达率1.3.8 统计分析 数据以均数±标准差(x±s)表示，采用 SPSS16.0 统计软件进行数据分析处理， 组间差异比较用 t 检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2、 结果

2.1 血小板回收率及稳定性 实验组和对照组间血小板计数有统计学意义(P<0.05)，冻干再水化血小板回收率为 49.36%
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